Comment[ArrayExpressAccession] E-GEOD-41404 MAGE-TAB Version 1.1 Public Release Date 2012-10-10 Investigation Title dark hypocotyls tor rnai-Dark hypocotyls TOR RNAi Comment[Submitted Name] dark hypocotyls tor rnai-Dark hypocotyls TOR RNAi Experiment Description fapesp-bra-inra-10-01_bioen_hypocotyl - dark hypocotyls tor rnai - Transcriptional comparison between 2 TOR RNAi mutants versus GUS control. - Sowing after 24h imbibition at 4M-BM-0C in the dark, on MS1/5, no sucrose, 10 mM ethanol, 8 g/l agar, vertical growth with 3h light, 6 days growth in the dark (20M-BM-0C), hypocotyls were harvested under green light ; cotyledons and root were removed. 4 dye-swap - normal vs rnai mutant comparaison Term Source Name ArrayExpress EFO Term Source File http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/ http://www.ebi.ac.uk/efo/efo.owl Person Last Name Ludivine Meyer Balzergue Taconnat Martin-Magniette Person First Name Soubigou-Taconnat Christian Sandrine Ludivine Marie-Laure Person Email soubigou@evry.inra.fr Person Affiliation INRA Person Address URGV, INRA, 2 rue gaston crM-CM-)mieux, evry, France Person Roles submitter Protocol Name P-GSE41404-2 P-GSE41404-1 P-GSE41404-8 P-GSE41404-18 P-GSE41404-11 P-GSE41404-21 P-GSE41404-13 P-GSE41404-14 P-GSE41404-20 P-GSE41404-17 P-GSE41404-4 P-GSE41404-10 P-GSE41404-9 P-GSE41404-3 P-GSE41404-16 P-GSE41404-5 P-GSE41404-19 P-GSE41404-15 P-GSE41404-7 P-GSE41404-12 P-GSE41404-6 Protocol Description ID_REF = ID number VALUE = Normalized log2 ratio median intensity of Ch2(Cy3)/Ch1(Cy5) (Ch1=reference) ID_REF = ID number VALUE = Normalized log2 ratio median intensity of Ch1(Cy5)/Ch2(Cy3) (Ch2=reference) 5.2 Repet1 Cy5 / GUS Repet1 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42M-0C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 M-5L as follows 15M-5l of purified, labeled cDNA, 15 M-5l of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 M-5L formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95M-0C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42M-0C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42M-0C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream. GUS Repet2 Cy5 / 5.2 Repet2 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42M-0C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 M-5L as follows 15M-5l of purified, labeled cDNA, 15 M-5l of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 M-5L formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95M-0C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42M-0C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42M-0C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream. GUS Repet1 Cy5 / 5.2 Repet1 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42M-0C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 M-5L as follows 15M-5l of purified, labeled cDNA, 15 M-5l of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 M-5L formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95M-0C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42M-0C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42M-0C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream. GUS Repet2 Cy5 / 6.3 Repet2 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42M-0C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 M-5L as follows 15M-5l of purified, labeled cDNA, 15 M-5l of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 M-5L formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95M-0C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42M-0C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42M-0C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream. 6.3 Repet1 Cy5 / GUS Repet1 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42M-0C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 M-5L as follows 15M-5l of purified, labeled cDNA, 15 M-5l of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 M-5L formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95M-0C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42M-0C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42M-0C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream. GUS Repet1 Cy5 / 6.3 Repet1 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42M-0C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 M-5L as follows 15M-5l of purified, labeled cDNA, 15 M-5l of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 M-5L formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95M-0C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42M-0C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42M-0C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream. 6.3 Repet2 Cy5 / GUS Repet2 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42M-0C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 M-5L as follows 15M-5l of purified, labeled cDNA, 15 M-5l of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 M-5L formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95M-0C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42M-0C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42M-0C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream. 5.2 Repet2 Cy5 / GUS Repet2 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42M-0C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 M-5L as follows 15M-5l of purified, labeled cDNA, 15 M-5l of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 M-5L formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95M-0C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42M-0C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42M-0C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream. hypocotyl - Media=MS 1/5, 10mM ethanol, 8g/l agar hygrometry=in vitro, Room 70% Temperature=20M-0C Light=DARK The raw data comprised the logarithm of median feature pixel intensity at wavelength 635 nm (red) and 532 nm (green). No background was subtracted. An array-by-array normalization was performed to remove systematic biases. First, we excluded spots that were considered badly formed features by the experimenter (Flags=-100). Then we performed a global intensity-dependent normalization using the loess procedure (see Yang et al., 2002) to correct the dye bias. Finally, on each block, the log-ratio median is subtracted from each value of the log-ratio of the block to correct a print-tip effect on each metablock. GenePix Pro 3.0, Cy3:pmt voltage 532nm,480V,laser power 35%, Cy5:635nm,pmt voltage 480V,laser power 30% Name:Ethanol induction - induction - compound addition,ethanol:quantity 10mM . Ethanol inducible lines, control: 35S:AlcR pAlcA:GUS, TOR RNAi 35S:AlcR pAlcA:TOR RNAi (FRB domain). GUS Repet2:1.4ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : rM-CM-)actifs enzymatiques M-CM- -20M-0C, tampons de purification M-CM- 4M-0C et colonnes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante. Si les concentrations en ARN sont infM-CM-)rieures M-CM- 180 ng/M-5l, prM-CM-)voir une prM-CM-)cipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiM-CM-)s et quantifiM-CM-)s au Ribogreen : ARN tot (1M-5g)+ eau 5.5 M-5l T7-oligo-dT 0.5 M-5l Incuber dans le bloc chauffant M-CM- 65M-0C 10min, centrifuger briM-CM-(vement , puis mettre sur glace. PrM-CM-)parer le Mix (prM-CM-)voir 5% en plus) en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace : 10X First Strand Buffer : 1M-5l Ribonuclease Inhibitor : 0.5M-5l dNTP Mix : 2M-5l Reverse Transcriptase 0.5M-5l Ajouter 4 M-5l de ce mix dans les 6M-5l d'ARN, agiter lM-CM-)gM-CM-(rement et centrifuger briM-CM-(vement. Volume final = 10 M-5l Incuber 2h dans un bain-marie M-CM- 42M-0C Centrifuger briM-CM-(vement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie M-CM- 16M-0C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prM-CM-)voir 5% en plus) en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace: Eau RNase-Free 31.5M-5l 10X 2nd Strand Buffer 5M-5l dNTP Mix 2M-5l DNA PolymM-CM-)rase 1M-5l RNase H. 0.5M-5l Ajouter 40 M-5l de ce mix aux 10 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents. Volume final = 50 M-5l. MM-CM-)langer par pipetage et centrifuger briM-CM-(vement. Incuber 2h M-CM- 16M-0C Ajouter 50 M-5l d'eau DEPC. PossibilitM-CM-) de garder les M-CM-)chantillons aprM-CM-(s cette M-CM-)tape M-CM- -20M-0C en attendant la purification Purification des cDNA: cette M-CM-)tape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le rM-CM-)gler M-CM- 50 M-0C. Y mettre l'eau RNase-free M-CM- prM-CM-)chauffer. M-CM-^@ 4 M-0C, le Binding Buffer peut avoir cristallisM-CM-), il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant briM-CM-(vement au bain marie M-CM- 50M-0C. Equilibrer la colonne: dM-CM-)poser 50 M-5l de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min M-CM- tempM-CM-)rature ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250M-5l de cDNA Binding Buffer dans les 100M-5l d'[ADN + eau] MM-CM-)langer par pipetage DM-CM-)poser le tout sur la colonne M-CM-)quilibrM-CM-)e Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : dM-CM-)poser 500 M-5l de cDNA Wash Buffer sur la colonne (VM-CM-)rifier que l'M-CM-)thanol a bien M-CM-)tM-CM-) ajoutM-CM-)) Centrifuger 1 minute M-CM- 10000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et centrifuger M-CM- nouveau 1 minute M-CM- 10 000g afin d'M-CM-)liminer les traces d'M-CM-)thanol TransfM-CM-)rer colonne dans un tube de 1.5 ml DM-CM-)poser au milieu de la colonne 5M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante et remettre l'eau M-CM- 50M-0C Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante RM-CM-)pM-CM-)ter l'M-CM-)lution dans le mM-CM-*me tube avec 5M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C et M-CM-)teindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthM-CM-(se d'aRNA(prM-CM-)voir 5% en plus) : PrM-CM-)parer le mix suivant en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace : 2M-5l ATP Soln (75mM) 2M-5l CTP Soln (75mM) 2M-5l GTP Soln (75mM) 2M-5l UTP Soln (75mM) 2M-5l T7 10X rM-CM-)action Buffer Attention : il peut avoir cristallisM-CM-) : bien le redissoudre avant utilisation 2M-5l T7 enzyme Mix MM-CM-)langer par pipetage, centrifugation brM-CM-(ve Ajouter 12 M-5l de ce mix dans les 8 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents. Volume final = 20 M-5l Incuber 14h dans l'M-CM-)tuve "bactM-CM-)rio" M-CM- 37M-0C. Rajouter 1 M-5l de DNase I, mM-CM-)langer par pipetage, centrifugation brM-CM-(ve Incuber 30min dans le bloc chauffant M-CM- 37M-0C. PossibilitM-CM-) de conserver M-CM- -20M-0C avant la purification Ajouter 80 M-5l "Elution Solution" M-CM- l'M-CM-)luat. Vf = 100M-5l. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le rM-CM-)gler M-CM- 50 M-0C. Y mettre l'eau RNase-free M-CM- prM-CM-)chauffer. Ajouter aux 100 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents : 350M-5l aRNA Binding Buffer 250M-5l EtOH 100%. MM-CM-)langer par pipetage et dM-CM-)poser l'M-CM-)chantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : dM-CM-)poser 650M-5l aRNA Wash Buffer sur la colonne (VM-CM-)rifier que l'M-CM-)thanol a bien M-CM-)tM-CM-) ajoutM-CM-)) Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et centrifuger M-CM- nouveau 1 minute M-CM- 10 000g afin d'M-CM-)liminer les traces d'M-CM-)thanol TransfM-CM-)rer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : dM-CM-)poser au milieu de la colonne 50M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante et remettre l'eau M-CM- 50M-0C Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante RM-CM-)pM-CM-)ter l'M-CM-)lution dans le mM-CM-*me tube : DM-CM-)poser au milieu de la colonne 50M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C et M-CM-)teindre le bain-marie Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Le volume final est entre 90 et 100 M-5l. Quantification : PrM-CM-)parer une dilution au 1/20 pour chaque M-CM-)chantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantitM-CM-) finale est infM-CM-)rieure M-CM- 50 M-5g, vM-CM-)rifier la qualitM-CM-) sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est infM-CM-)rieure M-CM- 625 ng/M-5l, prM-CM-)voir une prM-CM-)cipitation pour le marquage : Ajouter 10 M-5l de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 M-5l d'Ethanol 96,2% PrM-CM-)cipiter 1 heure M-CM- -20M-0C ou 30 minutes M-CM- -80M-0C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm M-CM- 4M-0C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 M-5l d'M-CM-)thanol M-CM- 70 % Centrifuger 5 minutes M-CM- 13 000 rpm M-CM- 4M-0C et pipeter le surnageant Laisser le culot sM-CM-)cher M-CM- l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free M-CM- une concentration de 1 M-5g/M-5l. 5.2 Repet1:1.48ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : rM-CM-)actifs enzymatiques M-CM- -20M-0C, tampons de purification M-CM- 4M-0C et colonnes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante. Si les concentrations en ARN sont infM-CM-)rieures M-CM- 180 ng/M-5l, prM-CM-)voir une prM-CM-)cipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiM-CM-)s et quantifiM-CM-)s au Ribogreen : ARN tot (1M-5g)+ eau 5.5 M-5l T7-oligo-dT 0.5 M-5l Incuber dans le bloc chauffant M-CM- 65M-0C 10min, centrifuger briM-CM-(vement , puis mettre sur glace. PrM-CM-)parer le Mix (prM-CM-)voir 5% en plus) en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace : 10X First Strand Buffer : 1M-5l Ribonuclease Inhibitor : 0.5M-5l dNTP Mix : 2M-5l Reverse Transcriptase 0.5M-5l Ajouter 4 M-5l de ce mix dans les 6M-5l d'ARN, agiter lM-CM-)gM-CM-(rement et centrifuger briM-CM-(vement. Volume final = 10 M-5l Incuber 2h dans un bain-marie M-CM- 42M-0C Centrifuger briM-CM-(vement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie M-CM- 16M-0C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prM-CM-)voir 5% en plus) en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace: Eau RNase-Free 31.5M-5l 10X 2nd Strand Buffer 5M-5l dNTP Mix 2M-5l DNA PolymM-CM-)rase 1M-5l RNase H. 0.5M-5l Ajouter 40 M-5l de ce mix aux 10 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents. Volume final = 50 M-5l. MM-CM-)langer par pipetage et centrifuger briM-CM-(vement. Incuber 2h M-CM- 16M-0C Ajouter 50 M-5l d'eau DEPC. PossibilitM-CM-) de garder les M-CM-)chantillons aprM-CM-(s cette M-CM-)tape M-CM- -20M-0C en attendant la purification Purification des cDNA: cette M-CM-)tape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le rM-CM-)gler M-CM- 50 M-0C. Y mettre l'eau RNase-free M-CM- prM-CM-)chauffer. M-CM-^@ 4 M-0C, le Binding Buffer peut avoir cristallisM-CM-), il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant briM-CM-(vement au bain marie M-CM- 50M-0C. Equilibrer la colonne: dM-CM-)poser 50 M-5l de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min M-CM- tempM-CM-)rature ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250M-5l de cDNA Binding Buffer dans les 100M-5l d'[ADN + eau] MM-CM-)langer par pipetage DM-CM-)poser le tout sur la colonne M-CM-)quilibrM-CM-)e Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : dM-CM-)poser 500 M-5l de cDNA Wash Buffer sur la colonne (VM-CM-)rifier que l'M-CM-)thanol a bien M-CM-)tM-CM-) ajoutM-CM-)) Centrifuger 1 minute M-CM- 10000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et centrifuger M-CM- nouveau 1 minute M-CM- 10 000g afin d'M-CM-)liminer les traces d'M-CM-)thanol TransfM-CM-)rer colonne dans un tube de 1.5 ml DM-CM-)poser au milieu de la colonne 5M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante et remettre l'eau M-CM- 50M-0C Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante RM-CM-)pM-CM-)ter l'M-CM-)lution dans le mM-CM-*me tube avec 5M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C et M-CM-)teindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthM-CM-(se d'aRNA(prM-CM-)voir 5% en plus) : PrM-CM-)parer le mix suivant en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace : 2M-5l ATP Soln (75mM) 2M-5l CTP Soln (75mM) 2M-5l GTP Soln (75mM) 2M-5l UTP Soln (75mM) 2M-5l T7 10X rM-CM-)action Buffer Attention : il peut avoir cristallisM-CM-) : bien le redissoudre avant utilisation 2M-5l T7 enzyme Mix MM-CM-)langer par pipetage, centrifugation brM-CM-(ve Ajouter 12 M-5l de ce mix dans les 8 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents. Volume final = 20 M-5l Incuber 14h dans l'M-CM-)tuve "bactM-CM-)rio" M-CM- 37M-0C. Rajouter 1 M-5l de DNase I, mM-CM-)langer par pipetage, centrifugation brM-CM-(ve Incuber 30min dans le bloc chauffant M-CM- 37M-0C. PossibilitM-CM-) de conserver M-CM- -20M-0C avant la purification Ajouter 80 M-5l "Elution Solution" M-CM- l'M-CM-)luat. Vf = 100M-5l. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le rM-CM-)gler M-CM- 50 M-0C. Y mettre l'eau RNase-free M-CM- prM-CM-)chauffer. Ajouter aux 100 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents : 350M-5l aRNA Binding Buffer 250M-5l EtOH 100%. MM-CM-)langer par pipetage et dM-CM-)poser l'M-CM-)chantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : dM-CM-)poser 650M-5l aRNA Wash Buffer sur la colonne (VM-CM-)rifier que l'M-CM-)thanol a bien M-CM-)tM-CM-) ajoutM-CM-)) Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et centrifuger M-CM- nouveau 1 minute M-CM- 10 000g afin d'M-CM-)liminer les traces d'M-CM-)thanol TransfM-CM-)rer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : dM-CM-)poser au milieu de la colonne 50M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante et remettre l'eau M-CM- 50M-0C Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante RM-CM-)pM-CM-)ter l'M-CM-)lution dans le mM-CM-*me tube : DM-CM-)poser au milieu de la colonne 50M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C et M-CM-)teindre le bain-marie Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Le volume final est entre 90 et 100 M-5l. Quantification : PrM-CM-)parer une dilution au 1/20 pour chaque M-CM-)chantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantitM-CM-) finale est infM-CM-)rieure M-CM- 50 M-5g, vM-CM-)rifier la qualitM-CM-) sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est infM-CM-)rieure M-CM- 625 ng/M-5l, prM-CM-)voir une prM-CM-)cipitation pour le marquage : Ajouter 10 M-5l de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 M-5l d'Ethanol 96,2% PrM-CM-)cipiter 1 heure M-CM- -20M-0C ou 30 minutes M-CM- -80M-0C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm M-CM- 4M-0C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 M-5l d'M-CM-)thanol M-CM- 70 % Centrifuger 5 minutes M-CM- 13 000 rpm M-CM- 4M-0C et pipeter le surnageant Laisser le culot sM-CM-)cher M-CM- l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free M-CM- une concentration de 1 M-5g/M-5l. 6.3 Repet2:3.06ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : rM-CM-)actifs enzymatiques M-CM- -20M-0C, tampons de purification M-CM- 4M-0C et colonnes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante. Si les concentrations en ARN sont infM-CM-)rieures M-CM- 180 ng/M-5l, prM-CM-)voir une prM-CM-)cipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiM-CM-)s et quantifiM-CM-)s au Ribogreen : ARN tot (1M-5g)+ eau 5.5 M-5l T7-oligo-dT 0.5 M-5l Incuber dans le bloc chauffant M-CM- 65M-0C 10min, centrifuger briM-CM-(vement , puis mettre sur glace. PrM-CM-)parer le Mix (prM-CM-)voir 5% en plus) en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace : 10X First Strand Buffer : 1M-5l Ribonuclease Inhibitor : 0.5M-5l dNTP Mix : 2M-5l Reverse Transcriptase 0.5M-5l Ajouter 4 M-5l de ce mix dans les 6M-5l d'ARN, agiter lM-CM-)gM-CM-(rement et centrifuger briM-CM-(vement. Volume final = 10 M-5l Incuber 2h dans un bain-marie M-CM- 42M-0C Centrifuger briM-CM-(vement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie M-CM- 16M-0C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prM-CM-)voir 5% en plus) en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace: Eau RNase-Free 31.5M-5l 10X 2nd Strand Buffer 5M-5l dNTP Mix 2M-5l DNA PolymM-CM-)rase 1M-5l RNase H. 0.5M-5l Ajouter 40 M-5l de ce mix aux 10 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents. Volume final = 50 M-5l. MM-CM-)langer par pipetage et centrifuger briM-CM-(vement. Incuber 2h M-CM- 16M-0C Ajouter 50 M-5l d'eau DEPC. PossibilitM-CM-) de garder les M-CM-)chantillons aprM-CM-(s cette M-CM-)tape M-CM- -20M-0C en attendant la purification Purification des cDNA: cette M-CM-)tape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le rM-CM-)gler M-CM- 50 M-0C. Y mettre l'eau RNase-free M-CM- prM-CM-)chauffer. M-CM-^@ 4 M-0C, le Binding Buffer peut avoir cristallisM-CM-), il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant briM-CM-(vement au bain marie M-CM- 50M-0C. Equilibrer la colonne: dM-CM-)poser 50 M-5l de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min M-CM- tempM-CM-)rature ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250M-5l de cDNA Binding Buffer dans les 100M-5l d'[ADN + eau] MM-CM-)langer par pipetage DM-CM-)poser le tout sur la colonne M-CM-)quilibrM-CM-)e Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : dM-CM-)poser 500 M-5l de cDNA Wash Buffer sur la colonne (VM-CM-)rifier que l'M-CM-)thanol a bien M-CM-)tM-CM-) ajoutM-CM-)) Centrifuger 1 minute M-CM- 10000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et centrifuger M-CM- nouveau 1 minute M-CM- 10 000g afin d'M-CM-)liminer les traces d'M-CM-)thanol TransfM-CM-)rer colonne dans un tube de 1.5 ml DM-CM-)poser au milieu de la colonne 5M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante et remettre l'eau M-CM- 50M-0C Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante RM-CM-)pM-CM-)ter l'M-CM-)lution dans le mM-CM-*me tube avec 5M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C et M-CM-)teindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthM-CM-(se d'aRNA(prM-CM-)voir 5% en plus) : PrM-CM-)parer le mix suivant en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace : 2M-5l ATP Soln (75mM) 2M-5l CTP Soln (75mM) 2M-5l GTP Soln (75mM) 2M-5l UTP Soln (75mM) 2M-5l T7 10X rM-CM-)action Buffer Attention : il peut avoir cristallisM-CM-) : bien le redissoudre avant utilisation 2M-5l T7 enzyme Mix MM-CM-)langer par pipetage, centrifugation brM-CM-(ve Ajouter 12 M-5l de ce mix dans les 8 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents. Volume final = 20 M-5l Incuber 14h dans l'M-CM-)tuve "bactM-CM-)rio" M-CM- 37M-0C. Rajouter 1 M-5l de DNase I, mM-CM-)langer par pipetage, centrifugation brM-CM-(ve Incuber 30min dans le bloc chauffant M-CM- 37M-0C. PossibilitM-CM-) de conserver M-CM- -20M-0C avant la purification Ajouter 80 M-5l "Elution Solution" M-CM- l'M-CM-)luat. Vf = 100M-5l. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le rM-CM-)gler M-CM- 50 M-0C. Y mettre l'eau RNase-free M-CM- prM-CM-)chauffer. Ajouter aux 100 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents : 350M-5l aRNA Binding Buffer 250M-5l EtOH 100%. MM-CM-)langer par pipetage et dM-CM-)poser l'M-CM-)chantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : dM-CM-)poser 650M-5l aRNA Wash Buffer sur la colonne (VM-CM-)rifier que l'M-CM-)thanol a bien M-CM-)tM-CM-) ajoutM-CM-)) Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et centrifuger M-CM- nouveau 1 minute M-CM- 10 000g afin d'M-CM-)liminer les traces d'M-CM-)thanol TransfM-CM-)rer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : dM-CM-)poser au milieu de la colonne 50M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante et remettre l'eau M-CM- 50M-0C Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante RM-CM-)pM-CM-)ter l'M-CM-)lution dans le mM-CM-*me tube : DM-CM-)poser au milieu de la colonne 50M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C et M-CM-)teindre le bain-marie Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Le volume final est entre 90 et 100 M-5l. Quantification : PrM-CM-)parer une dilution au 1/20 pour chaque M-CM-)chantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantitM-CM-) finale est infM-CM-)rieure M-CM- 50 M-5g, vM-CM-)rifier la qualitM-CM-) sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est infM-CM-)rieure M-CM- 625 ng/M-5l, prM-CM-)voir une prM-CM-)cipitation pour le marquage : Ajouter 10 M-5l de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 M-5l d'Ethanol 96,2% PrM-CM-)cipiter 1 heure M-CM- -20M-0C ou 30 minutes M-CM- -80M-0C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm M-CM- 4M-0C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 M-5l d'M-CM-)thanol M-CM- 70 % Centrifuger 5 minutes M-CM- 13 000 rpm M-CM- 4M-0C et pipeter le surnageant Laisser le culot sM-CM-)cher M-CM- l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free M-CM- une concentration de 1 M-5g/M-5l. 5.2 Repet2:1ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : rM-CM-)actifs enzymatiques M-CM- -20M-0C, tampons de purification M-CM- 4M-0C et colonnes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante. Si les concentrations en ARN sont infM-CM-)rieures M-CM- 180 ng/M-5l, prM-CM-)voir une prM-CM-)cipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiM-CM-)s et quantifiM-CM-)s au Ribogreen : ARN tot (1M-5g)+ eau 5.5 M-5l T7-oligo-dT 0.5 M-5l Incuber dans le bloc chauffant M-CM- 65M-0C 10min, centrifuger briM-CM-(vement , puis mettre sur glace. PrM-CM-)parer le Mix (prM-CM-)voir 5% en plus) en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace : 10X First Strand Buffer : 1M-5l Ribonuclease Inhibitor : 0.5M-5l dNTP Mix : 2M-5l Reverse Transcriptase 0.5M-5l Ajouter 4 M-5l de ce mix dans les 6M-5l d'ARN, agiter lM-CM-)gM-CM-(rement et centrifuger briM-CM-(vement. Volume final = 10 M-5l Incuber 2h dans un bain-marie M-CM- 42M-0C Centrifuger briM-CM-(vement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie M-CM- 16M-0C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prM-CM-)voir 5% en plus) en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace: Eau RNase-Free 31.5M-5l 10X 2nd Strand Buffer 5M-5l dNTP Mix 2M-5l DNA PolymM-CM-)rase 1M-5l RNase H. 0.5M-5l Ajouter 40 M-5l de ce mix aux 10 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents. Volume final = 50 M-5l. MM-CM-)langer par pipetage et centrifuger briM-CM-(vement. Incuber 2h M-CM- 16M-0C Ajouter 50 M-5l d'eau DEPC. PossibilitM-CM-) de garder les M-CM-)chantillons aprM-CM-(s cette M-CM-)tape M-CM- -20M-0C en attendant la purification Purification des cDNA: cette M-CM-)tape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le rM-CM-)gler M-CM- 50 M-0C. Y mettre l'eau RNase-free M-CM- prM-CM-)chauffer. M-CM-^@ 4 M-0C, le Binding Buffer peut avoir cristallisM-CM-), il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant briM-CM-(vement au bain marie M-CM- 50M-0C. Equilibrer la colonne: dM-CM-)poser 50 M-5l de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min M-CM- tempM-CM-)rature ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250M-5l de cDNA Binding Buffer dans les 100M-5l d'[ADN + eau] MM-CM-)langer par pipetage DM-CM-)poser le tout sur la colonne M-CM-)quilibrM-CM-)e Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : dM-CM-)poser 500 M-5l de cDNA Wash Buffer sur la colonne (VM-CM-)rifier que l'M-CM-)thanol a bien M-CM-)tM-CM-) ajoutM-CM-)) Centrifuger 1 minute M-CM- 10000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et centrifuger M-CM- nouveau 1 minute M-CM- 10 000g afin d'M-CM-)liminer les traces d'M-CM-)thanol TransfM-CM-)rer colonne dans un tube de 1.5 ml DM-CM-)poser au milieu de la colonne 5M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante et remettre l'eau M-CM- 50M-0C Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante RM-CM-)pM-CM-)ter l'M-CM-)lution dans le mM-CM-*me tube avec 5M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C et M-CM-)teindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthM-CM-(se d'aRNA(prM-CM-)voir 5% en plus) : PrM-CM-)parer le mix suivant en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace : 2M-5l ATP Soln (75mM) 2M-5l CTP Soln (75mM) 2M-5l GTP Soln (75mM) 2M-5l UTP Soln (75mM) 2M-5l T7 10X rM-CM-)action Buffer Attention : il peut avoir cristallisM-CM-) : bien le redissoudre avant utilisation 2M-5l T7 enzyme Mix MM-CM-)langer par pipetage, centrifugation brM-CM-(ve Ajouter 12 M-5l de ce mix dans les 8 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents. Volume final = 20 M-5l Incuber 14h dans l'M-CM-)tuve "bactM-CM-)rio" M-CM- 37M-0C. Rajouter 1 M-5l de DNase I, mM-CM-)langer par pipetage, centrifugation brM-CM-(ve Incuber 30min dans le bloc chauffant M-CM- 37M-0C. PossibilitM-CM-) de conserver M-CM- -20M-0C avant la purification Ajouter 80 M-5l "Elution Solution" M-CM- l'M-CM-)luat. Vf = 100M-5l. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le rM-CM-)gler M-CM- 50 M-0C. Y mettre l'eau RNase-free M-CM- prM-CM-)chauffer. Ajouter aux 100 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents : 350M-5l aRNA Binding Buffer 250M-5l EtOH 100%. MM-CM-)langer par pipetage et dM-CM-)poser l'M-CM-)chantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : dM-CM-)poser 650M-5l aRNA Wash Buffer sur la colonne (VM-CM-)rifier que l'M-CM-)thanol a bien M-CM-)tM-CM-) ajoutM-CM-)) Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et centrifuger M-CM- nouveau 1 minute M-CM- 10 000g afin d'M-CM-)liminer les traces d'M-CM-)thanol TransfM-CM-)rer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : dM-CM-)poser au milieu de la colonne 50M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante et remettre l'eau M-CM- 50M-0C Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante RM-CM-)pM-CM-)ter l'M-CM-)lution dans le mM-CM-*me tube : DM-CM-)poser au milieu de la colonne 50M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C et M-CM-)teindre le bain-marie Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Le volume final est entre 90 et 100 M-5l. Quantification : PrM-CM-)parer une dilution au 1/20 pour chaque M-CM-)chantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantitM-CM-) finale est infM-CM-)rieure M-CM- 50 M-5g, vM-CM-)rifier la qualitM-CM-) sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est infM-CM-)rieure M-CM- 625 ng/M-5l, prM-CM-)voir une prM-CM-)cipitation pour le marquage : Ajouter 10 M-5l de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 M-5l d'Ethanol 96,2% PrM-CM-)cipiter 1 heure M-CM- -20M-0C ou 30 minutes M-CM- -80M-0C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm M-CM- 4M-0C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 M-5l d'M-CM-)thanol M-CM- 70 % Centrifuger 5 minutes M-CM- 13 000 rpm M-CM- 4M-0C et pipeter le surnageant Laisser le culot sM-CM-)cher M-CM- l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free M-CM- une concentration de 1 M-5g/M-5l. GUS Repet1:2.07ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : rM-CM-)actifs enzymatiques M-CM- -20M-0C, tampons de purification M-CM- 4M-0C et colonnes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante. Si les concentrations en ARN sont infM-CM-)rieures M-CM- 180 ng/M-5l, prM-CM-)voir une prM-CM-)cipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiM-CM-)s et quantifiM-CM-)s au Ribogreen : ARN tot (1M-5g)+ eau 5.5 M-5l T7-oligo-dT 0.5 M-5l Incuber dans le bloc chauffant M-CM- 65M-0C 10min, centrifuger briM-CM-(vement , puis mettre sur glace. PrM-CM-)parer le Mix (prM-CM-)voir 5% en plus) en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace : 10X First Strand Buffer : 1M-5l Ribonuclease Inhibitor : 0.5M-5l dNTP Mix : 2M-5l Reverse Transcriptase 0.5M-5l Ajouter 4 M-5l de ce mix dans les 6M-5l d'ARN, agiter lM-CM-)gM-CM-(rement et centrifuger briM-CM-(vement. Volume final = 10 M-5l Incuber 2h dans un bain-marie M-CM- 42M-0C Centrifuger briM-CM-(vement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie M-CM- 16M-0C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prM-CM-)voir 5% en plus) en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace: Eau RNase-Free 31.5M-5l 10X 2nd Strand Buffer 5M-5l dNTP Mix 2M-5l DNA PolymM-CM-)rase 1M-5l RNase H. 0.5M-5l Ajouter 40 M-5l de ce mix aux 10 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents. Volume final = 50 M-5l. MM-CM-)langer par pipetage et centrifuger briM-CM-(vement. Incuber 2h M-CM- 16M-0C Ajouter 50 M-5l d'eau DEPC. PossibilitM-CM-) de garder les M-CM-)chantillons aprM-CM-(s cette M-CM-)tape M-CM- -20M-0C en attendant la purification Purification des cDNA: cette M-CM-)tape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le rM-CM-)gler M-CM- 50 M-0C. Y mettre l'eau RNase-free M-CM- prM-CM-)chauffer. M-CM-^@ 4 M-0C, le Binding Buffer peut avoir cristallisM-CM-), il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant briM-CM-(vement au bain marie M-CM- 50M-0C. Equilibrer la colonne: dM-CM-)poser 50 M-5l de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min M-CM- tempM-CM-)rature ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250M-5l de cDNA Binding Buffer dans les 100M-5l d'[ADN + eau] MM-CM-)langer par pipetage DM-CM-)poser le tout sur la colonne M-CM-)quilibrM-CM-)e Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : dM-CM-)poser 500 M-5l de cDNA Wash Buffer sur la colonne (VM-CM-)rifier que l'M-CM-)thanol a bien M-CM-)tM-CM-) ajoutM-CM-)) Centrifuger 1 minute M-CM- 10000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et centrifuger M-CM- nouveau 1 minute M-CM- 10 000g afin d'M-CM-)liminer les traces d'M-CM-)thanol TransfM-CM-)rer colonne dans un tube de 1.5 ml DM-CM-)poser au milieu de la colonne 5M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante et remettre l'eau M-CM- 50M-0C Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante RM-CM-)pM-CM-)ter l'M-CM-)lution dans le mM-CM-*me tube avec 5M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C et M-CM-)teindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthM-CM-(se d'aRNA(prM-CM-)voir 5% en plus) : PrM-CM-)parer le mix suivant en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace : 2M-5l ATP Soln (75mM) 2M-5l CTP Soln (75mM) 2M-5l GTP Soln (75mM) 2M-5l UTP Soln (75mM) 2M-5l T7 10X rM-CM-)action Buffer Attention : il peut avoir cristallisM-CM-) : bien le redissoudre avant utilisation 2M-5l T7 enzyme Mix MM-CM-)langer par pipetage, centrifugation brM-CM-(ve Ajouter 12 M-5l de ce mix dans les 8 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents. Volume final = 20 M-5l Incuber 14h dans l'M-CM-)tuve "bactM-CM-)rio" M-CM- 37M-0C. Rajouter 1 M-5l de DNase I, mM-CM-)langer par pipetage, centrifugation brM-CM-(ve Incuber 30min dans le bloc chauffant M-CM- 37M-0C. PossibilitM-CM-) de conserver M-CM- -20M-0C avant la purification Ajouter 80 M-5l "Elution Solution" M-CM- l'M-CM-)luat. Vf = 100M-5l. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le rM-CM-)gler M-CM- 50 M-0C. Y mettre l'eau RNase-free M-CM- prM-CM-)chauffer. Ajouter aux 100 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents : 350M-5l aRNA Binding Buffer 250M-5l EtOH 100%. MM-CM-)langer par pipetage et dM-CM-)poser l'M-CM-)chantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : dM-CM-)poser 650M-5l aRNA Wash Buffer sur la colonne (VM-CM-)rifier que l'M-CM-)thanol a bien M-CM-)tM-CM-) ajoutM-CM-)) Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et centrifuger M-CM- nouveau 1 minute M-CM- 10 000g afin d'M-CM-)liminer les traces d'M-CM-)thanol TransfM-CM-)rer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : dM-CM-)poser au milieu de la colonne 50M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante et remettre l'eau M-CM- 50M-0C Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante RM-CM-)pM-CM-)ter l'M-CM-)lution dans le mM-CM-*me tube : DM-CM-)poser au milieu de la colonne 50M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C et M-CM-)teindre le bain-marie Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Le volume final est entre 90 et 100 M-5l. Quantification : PrM-CM-)parer une dilution au 1/20 pour chaque M-CM-)chantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantitM-CM-) finale est infM-CM-)rieure M-CM- 50 M-5g, vM-CM-)rifier la qualitM-CM-) sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est infM-CM-)rieure M-CM- 625 ng/M-5l, prM-CM-)voir une prM-CM-)cipitation pour le marquage : Ajouter 10 M-5l de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 M-5l d'Ethanol 96,2% PrM-CM-)cipiter 1 heure M-CM- -20M-0C ou 30 minutes M-CM- -80M-0C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm M-CM- 4M-0C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 M-5l d'M-CM-)thanol M-CM- 70 % Centrifuger 5 minutes M-CM- 13 000 rpm M-CM- 4M-0C et pipeter le surnageant Laisser le culot sM-CM-)cher M-CM- l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free M-CM- une concentration de 1 M-5g/M-5l. 6.3 Repet1:3.11ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : rM-CM-)actifs enzymatiques M-CM- -20M-0C, tampons de purification M-CM- 4M-0C et colonnes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante. Si les concentrations en ARN sont infM-CM-)rieures M-CM- 180 ng/M-5l, prM-CM-)voir une prM-CM-)cipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiM-CM-)s et quantifiM-CM-)s au Ribogreen : ARN tot (1M-5g)+ eau 5.5 M-5l T7-oligo-dT 0.5 M-5l Incuber dans le bloc chauffant M-CM- 65M-0C 10min, centrifuger briM-CM-(vement , puis mettre sur glace. PrM-CM-)parer le Mix (prM-CM-)voir 5% en plus) en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace : 10X First Strand Buffer : 1M-5l Ribonuclease Inhibitor : 0.5M-5l dNTP Mix : 2M-5l Reverse Transcriptase 0.5M-5l Ajouter 4 M-5l de ce mix dans les 6M-5l d'ARN, agiter lM-CM-)gM-CM-(rement et centrifuger briM-CM-(vement. Volume final = 10 M-5l Incuber 2h dans un bain-marie M-CM- 42M-0C Centrifuger briM-CM-(vement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie M-CM- 16M-0C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prM-CM-)voir 5% en plus) en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace: Eau RNase-Free 31.5M-5l 10X 2nd Strand Buffer 5M-5l dNTP Mix 2M-5l DNA PolymM-CM-)rase 1M-5l RNase H. 0.5M-5l Ajouter 40 M-5l de ce mix aux 10 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents. Volume final = 50 M-5l. MM-CM-)langer par pipetage et centrifuger briM-CM-(vement. Incuber 2h M-CM- 16M-0C Ajouter 50 M-5l d'eau DEPC. PossibilitM-CM-) de garder les M-CM-)chantillons aprM-CM-(s cette M-CM-)tape M-CM- -20M-0C en attendant la purification Purification des cDNA: cette M-CM-)tape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le rM-CM-)gler M-CM- 50 M-0C. Y mettre l'eau RNase-free M-CM- prM-CM-)chauffer. M-CM-^@ 4 M-0C, le Binding Buffer peut avoir cristallisM-CM-), il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant briM-CM-(vement au bain marie M-CM- 50M-0C. Equilibrer la colonne: dM-CM-)poser 50 M-5l de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min M-CM- tempM-CM-)rature ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250M-5l de cDNA Binding Buffer dans les 100M-5l d'[ADN + eau] MM-CM-)langer par pipetage DM-CM-)poser le tout sur la colonne M-CM-)quilibrM-CM-)e Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : dM-CM-)poser 500 M-5l de cDNA Wash Buffer sur la colonne (VM-CM-)rifier que l'M-CM-)thanol a bien M-CM-)tM-CM-) ajoutM-CM-)) Centrifuger 1 minute M-CM- 10000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et centrifuger M-CM- nouveau 1 minute M-CM- 10 000g afin d'M-CM-)liminer les traces d'M-CM-)thanol TransfM-CM-)rer colonne dans un tube de 1.5 ml DM-CM-)poser au milieu de la colonne 5M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante et remettre l'eau M-CM- 50M-0C Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante RM-CM-)pM-CM-)ter l'M-CM-)lution dans le mM-CM-*me tube avec 5M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C et M-CM-)teindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthM-CM-(se d'aRNA(prM-CM-)voir 5% en plus) : PrM-CM-)parer le mix suivant en mettant l'enzyme M-CM- la derniM-CM-(re minute, sur glace : 2M-5l ATP Soln (75mM) 2M-5l CTP Soln (75mM) 2M-5l GTP Soln (75mM) 2M-5l UTP Soln (75mM) 2M-5l T7 10X rM-CM-)action Buffer Attention : il peut avoir cristallisM-CM-) : bien le redissoudre avant utilisation 2M-5l T7 enzyme Mix MM-CM-)langer par pipetage, centrifugation brM-CM-(ve Ajouter 12 M-5l de ce mix dans les 8 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents. Volume final = 20 M-5l Incuber 14h dans l'M-CM-)tuve "bactM-CM-)rio" M-CM- 37M-0C. Rajouter 1 M-5l de DNase I, mM-CM-)langer par pipetage, centrifugation brM-CM-(ve Incuber 30min dans le bloc chauffant M-CM- 37M-0C. PossibilitM-CM-) de conserver M-CM- -20M-0C avant la purification Ajouter 80 M-5l "Elution Solution" M-CM- l'M-CM-)luat. Vf = 100M-5l. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le rM-CM-)gler M-CM- 50 M-0C. Y mettre l'eau RNase-free M-CM- prM-CM-)chauffer. Ajouter aux 100 M-5l prM-CM-)cM-CM-)dents : 350M-5l aRNA Binding Buffer 250M-5l EtOH 100%. MM-CM-)langer par pipetage et dM-CM-)poser l'M-CM-)chantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : dM-CM-)poser 650M-5l aRNA Wash Buffer sur la colonne (VM-CM-)rifier que l'M-CM-)thanol a bien M-CM-)tM-CM-) ajoutM-CM-)) Centrifuger 1 minute M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Jeter le liquide et centrifuger M-CM- nouveau 1 minute M-CM- 10 000g afin d'M-CM-)liminer les traces d'M-CM-)thanol TransfM-CM-)rer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : dM-CM-)poser au milieu de la colonne 50M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante et remettre l'eau M-CM- 50M-0C Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante RM-CM-)pM-CM-)ter l'M-CM-)lution dans le mM-CM-*me tube : DM-CM-)poser au milieu de la colonne 50M-5l d'eau RNase-free M-CM- 50M-0C et M-CM-)teindre le bain-marie Incuber 2 minutes M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Centrifuger 1,5 minutes M-CM- 10 000g M-CM- tempM-CM-)rature ambiante Le volume final est entre 90 et 100 M-5l. Quantification : PrM-CM-)parer une dilution au 1/20 pour chaque M-CM-)chantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantitM-CM-) finale est infM-CM-)rieure M-CM- 50 M-5g, vM-CM-)rifier la qualitM-CM-) sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est infM-CM-)rieure M-CM- 625 ng/M-5l, prM-CM-)voir une prM-CM-)cipitation pour le marquage : Ajouter 10 M-5l de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 M-5l d'Ethanol 96,2% PrM-CM-)cipiter 1 heure M-CM- -20M-0C ou 30 minutes M-CM- -80M-0C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm M-CM- 4M-0C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 M-5l d'M-CM-)thanol M-CM- 70 % Centrifuger 5 minutes M-CM- 13 000 rpm M-CM- 4M-0C et pipeter le surnageant Laisser le culot sM-CM-)cher M-CM- l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free M-CM- une concentration de 1 M-5g/M-5l. labelling Cy3 and Cy5 direct, amplification=yes, aRNA 5 ug. (Labelling_protocol.txt) Labelling protocol: 5 M-5g of aRNA (8M-5l) mixed with 2 M-5l of random nonamers 1M-5g/M-5l and 0.5 M-5l of RNAse Out 40 U/M-5l, denatured 10 min at 70 M-0C and chilled on ice. The followig components were added to the sample 4 M-5l of first strand buffer 5 X, 1 M-5l of 10 mM dNTP/2mM dCTP, 2 M-5l of 0.1 M DTT, 1.5 M-5l of Cy3-dCTP or Cy5-dCTP (Amersham Pharmacia Biotech, 25nmol tube, PA5502), 1 M-5l of SuperScript II RT 200U/M-5l. Then it was incubated at 42M-0C for 2.5 hours and chilled on ice. The sample was denaturated by adding 2 M-5l of NaOH 2.5M and incubated at 37 M-0C for exactly 15 min, then was added 10 M-5l of 2M MOPS and put on ice. The dyes were purified with the QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). Protocol Type bioassay_data_transformation bioassay_data_transformation hybridization hybridization hybridization hybridization hybridization hybridization hybridization hybridization grow feature_extraction image_aquisition specified_biomaterial_action nucleic_acid_extraction nucleic_acid_extraction nucleic_acid_extraction nucleic_acid_extraction nucleic_acid_extraction nucleic_acid_extraction labeling Experimental Factor Name VARIATION Experimental Factor Type variation Comment[SecondaryAccession] GSE41404 Comment[GEOReleaseDate] 2012-10-10 Comment[ArrayExpressSubmissionDate] 2012-10-08 Comment[GEOLastUpdateDate] 2012-10-11 Comment[AEExperimentType] transcription profiling by array SDRF File E-GEOD-41404.sdrf.txt